đ Eksplorasi & Komparasi Topik Dokumen
Pencarian topik
Hasil Dokumen
Ditemukan: 17 dokumenKONSTRUKSI, EKSPRESI, DAN KARAKTERISASI ?-AMILASE REKOMBINAN N205D DAN N205A BACILLUS MEGATERIUM NL3
?-Amilase (EC 3.2.1.1) menghidrolisis ikatan ?-1,4-glikosidik pada pati menghasilkan campuran oligosakarida. BmaN2 merupakan salah satu ?-amilase yang diperoleh dari Bacillus megaterium NL3, suatu isolat dari Danau Kakaban Indonesia. Berdasarkan analisis kekerabatan urutan asam amino keluarga ?-amilase, residu asam amino asparagin nomor 205 (N205) BmaN2 berada pada daerah pengikatan ion kalsium, tetapi fungsinya belum diketahui dengan pasti. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari peran N205 terhadap aktivitas BmaN2. Site directed mutagenesis digunakan untuk mengubah N205 menjadi alanin (N205A) dan menjadi asam aspartat (N205D). Escherichia coli TOP10Fâ sebagai sel inang kloning ditransformasi dengan pET30a-bmaN2 N205A dan pET30a- bmaN2 N205D. Keberhasilan mutasi BmaN2 N205A dan BmaN2 N205D dipastikan dengan sekuensing. Berdasarkan hasil sekuensing, urutan asam amino BmaN2 telah berubah sesuai yang diinginkan, yaitu BmaN2 N205A dan BmaN2 N205D. Kodon asparagin (AAT) berubah menjadi kodon alanin (GCG) pada pET30a-bmaN2 N205A dan menjadi kodon asam aspartat (GAT) pada pET30a-bmaN2 N205D. Escherichia coli BL21(DE3) sebagai sel inang ekspresi ditransformasi dengan pET30a-bmaN2 N205A dan pET30a-bmaN2 N205D. Ekspresi bmaN2, bmaN2 N205A, dan bmaN2 N205D dilakukan dengan induksi IPTG 0,1 mM pada suhu ruang selama 3 jam 30 menit. BmaN2 wild type, BmaN2 N205A, dan BmaN2 N205D memiliki ukuran Âą 62 kDa. Aktivitas ekstrak kasar BmaN2 wild type, BmaN2 N205A, dan BmaN2 N205D diuji dengan metode asam 3,5- dinitrosalisilat (DNS) menggunakan substrat larutan pati 1% (b/v), secara berurutan menghasilkan nilai aktivitas lisat sebesar 11,53 Âą 0,06, 5,54 Âą 0,06, dan 25,05 Âą 0,18 U/mg. Protein BmaN2 wild type, BmaN2 N205A, dan BmaN2 N205D berhasil dimurnikan menggunakan metode kromatografi afinitas Ni-NTA menghasilkan pita tunggal pada elektroforegram SDS-PAGE. Berdasarkan analisis bioinformatika dan aktivitas enzim, N205 diprediksi sebagai residu yang mempengaruhi aktivitas enzim.
ANALISIS BIOINFORMATIKA UNTUK ISOLASI GEN PENGODE SORTASE F DARI ROSSELLOMOREA AQUIMARIS MKSC 6.2
Sortase memiliki peran dalam ekspresi protein membran pada bakteri Gram-positif. Protein yang diekspresi memiliki beragam fungsi, terutama terkait pengaruhnya terhadap virulensi mikroorganisme patogenik. Terdapat banyak jenis sortase (A â F), masing-masing memiliki karakteristik dan fungsi fisiologis yang berbeda. Sortase A dari Staphylococcus aureus telah banyak dipelajari dan memberi gambaran mengenai cara kerja sortase. Mekanisme reaksi enzimatis oleh sortase mengikuti mekanisme protease sistein dengan triad katalitik berupa sistein, histidin, dan arginin. Sortase jenis F memiliki fungsi dan mekanisme yang mirip dengan sortase jenis A, namun dapat menjalankan fungsinya tanpa ion kofaktor Ca2+. Rossellomorea aquimaris memiliki sortase jenis D dan F. Gen sortase D pada R. aquimaris sudah banyak dikaji, sedangkan penelitian terhadap sortase jenis F masih sedikit dan fungsi fisiologisnya belum konklusif. Penelitian ini dilakukan untuk memberikan penjelasan terkait struktur sortase F pada R. aquimaris MKSC 6.2 menggunakan analisis bioinformatika, serta mengembangkan metode untuk mengisolasi dan memperbanyak gen pengode protein tersebut (srtF). Hasil analisis menunjukkan terdapatnya dua jenis sortase F yang berbeda pada R. aquimaris, diberi nama sortase F 5T_A dan 5T_B. Kedua protein tersebut memiliki peptida sinyal (berperan dalam sekresi dan penempatan protein transmembran) yang berbeda dan sortase F 5T_B memiliki domain N-terminal, kedua hal tersebut berpotensi menentukan peran fisiologis masing-masing jenis sortase F. Berdasarkan hasil analisis bioinformatika, primer terdegenerasi dirancang dari urutan asam amino domain katalitik terkonservasi. Amplifikasi genom dengan primer ini menghasilkan fragmen berukuran 222 pb. Fragmen ini lalu diligasikan ke vektor kloning pGEM-T Easy dan ditentukan urutan nukelotidanya. Elektroferogram hasil sekuensing tidak menunjukkan urutan nukleotida yang sesuai dengan urutan nukleotida gen pengode sortase F. Disimpulkan primer terdegenerasi sortase F yang dibuat berdasarkan domain katalitik terkonservasi tidak menghasilkan fragmen DNA yang diinginkan, sehingga dilakukan desain primer baru berbasis sekuens lengkap gen pengode sortase F 5T_B.