📚 Eksplorasi & Komparasi Topik Dokumen
Pencarian topik
Hasil Dokumen
Ditemukan: 3 dokumenOPTIMASI EKSPRESI GEN PENGKODE ENDOGLUKANASE REKOMBINAN PADA SISTEM RAGI PICHIA PASTORIS
Endoglukanase merupakan enzim yang berperan dalam pemecahan selulosa, komponen utama dinding sel tumbuhan yang melimpah pada biomassa alam. Enzim ini memiliki peran krusial dalam industri kertas, tekstil, pengolahan limbah, dan bioenergi. Namun, produksi endoglukanase secara alami masih terbatas, sehingga pengembangan metode produksi efektif melalui pendekatan bioteknologi sangat diperlukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengekspresikan gen endoglukanase rekombinan menggunakan sistem ragi Pichia pastoris dan mengoptimasi kondisi produksi endoglukanase. Tahapan penelitian meliputi seleksi koloni transforman P. pastoris, induksi ekspresi gen menggunakan variasi konsentrasi metanol 1?3% (v/v) selama 5 hari inkubasi pada kepadatan awal sel OD1 dan OD5. Kuantifikasi protein selanjutnya ditentukan dengan metode Bradford. Aktivitas dilakukan dengan menentukan jumlah gula pereduksi hasil hidrolisis substrat carboxymethyl cellulose (CMC) 1% (b/v) menggunakan metode DNS. Analisis terhadap elektroforegram poliakrilamid SDS-PAGE mengonfirmasi keberhasilan sekresi protein rekombinan dalam sel P. pastoris dengan munculnya pita spesifik berukuran 38 kDa. Pada kelompok OD1, aktivitas spesifik tertinggi diperoleh dari perlakuan metanol 2,5% (v/v) sebesar 8,8 ± 1,2 U/mg, sedangkan pada kelompok OD5 aktivitas spesifik enzim optimal (9,2 ± 0,7 U/mg) diperoleh pada perlakuan metanol 2% (v/v). Oleh karena itu, pengujian fungsional menunjukkan bahwa puncak nilai aktivitas spesifik tertinggi dicapai pada hari ke-2 inkubasi untuk kedua variasi kerapatan sel walaupun pertumbuhan sel ragi paling optimal pada hari ke-4. Sejalan dengan hal tersebut, validasi statistik menggunakan Pareto Plot menegaskan bahwa faktor hari (waktu inkubasi) dan OD (kerapatan awal sel) merupakan dua parameter utama yang memberikan kontribusi paling dominan (Magnitude of Effect) dalam mengontrol fluktuasi aktivitas spesifik enzim endoglukanase rekombinan
PRODUKSI TEV PROTEASE REKOMBINAN DALAM SISTEM EKSPRESI \TEXT{E. COLI} BL21 (DE3)
TEV protease merupakan protease sistein dari Tobacco Etch Virus, memiliki spesifisitas tinggi, sehingga diaplikasikan untuk pemurnian protein pada bidang bioteknologi untuk pelepasan tag fusi. Selain itu, TEV protease dapat diaplikasikan pada sektor lain, seperti material, farmasi, dan diagnostik. Potensi aplikasi TEV protease mendorong peningkatan produksi dari enzim ini, sehingga penelitian ini bertujuan untuk memproduksi TEV protease rekombinan menggunakan sistem ekspresi Escherichia coli BL21(DE3) serta mengonfirmasi sekuens gen dan protein yang diekspresikan. Penelitian ini dimulai dengan prediksi karakteristik protein secara in silico. Selanjutnya, dilakukan kloning plasmid rekombinan dengan meligasi gen pengkode TEV protease (insert) dengan vektor pET16b. Hasil ligasi ditransformasi ke dalam sel E. coli TOP10, sel ditumbuhkan dan dilakukan penapisan. Untuk mengonfirmasi keberadaan plasmid hasil kloning, dilakukan PCR dan sekuensing. Setelah sekuens dikonfirmasi, dilakukan ekspresi protein rekombinan dengan menumbuhkan kultur E. coli BL21(DE3) hasil transformasi dan diinduksi dengan IPTG. Selanjutnya sel dipanen, dilisiskan dengan sonikator, dan dikonfirmasi dengan SDS-PAGE. Hasil penelitian secara in silico menunjukkan karakteristik protein yang memiliki bobot molekul 30,1 kDa dan sifat insolubel. Selain itu, hasil kloning terkonfirmasi oleh PCR memiliki insert sepanjang 751 bp dan panjang konfirmasi primer T7 ~954 bp, dan hasil sekuensing yang menunjukkan ketidaksesuaian sekuens TEV protease, sehingga belum dapat dikonfirmasi kesesuaian urutan nukleotida pengkode TEV. Terakhir, hasil protein yang diekspresikan teramati adanya pita protein rekombinan dengan bobot ~30 kDa pada fraksi insolubel baik pada perlakuan induksi IPTG 0,6 mM maupun tanpa induksi IPTG. Dengan demikian, kesimpulan dari penelitian ini adalah produksi TEV protease rekombinan berhasil dilakukan. Namun, karena hasil sekuensing menunjukkan ketidaksesuaian sekuens TEV protease, diperlukan analisis lebih lanjut untuk memastikan TEV protease. Selain itu, optimasi produksi diperlukan karena protein masih dihasilkan dalam bentuk insolubel, sebagai upaya untuk produksi TEV protease yang lebih efisien.
EVALUASI PRODUKSI PROTEIN REKOMBINAN RETEPLASE HASIL FUSI DENGAN SINYAL PEPTIDA PELB DAN TORA
Reteplase, protein rekombinan turunan dari tissue plasminogen activator (tPA) merupakan salah satu enzim fibrinolitik yang penting dalam terapi trombolitik untuk mengobati penyakit infark miokard akut (IMA). Namun produksi reteplase pada Escherichia coli seringkali menghasilkan agregat protein tidak terlarut yang dikenal sebagai badan inklusi. Reteplase juga mengandung beberapa ikatan disulfida yang penting untuk stabilitas dan aktivitas biologinya yang seringkali menjadi tantangan untuk mendapatkan ikatan disulfida yang benar apabila diproduksi di sitoplasma E. coli. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh sinyal peptida PelB dan TorA terhadap kelarutan dan aktivitas protein reteplase dan mengetahui kondisi optimal produksi reteplase yang telah di fusi dengan sinyal peptida PelB dan TorA. Dalam penelitian ini, gen pengkode sinyal peptida pelB dan torA dikloning ke dalam vektor ekspresi pET24b_ret untuk menghasilkan pET24b_ret_pelB dan pET24b_ret_torA dan ditransformasikan ke dalam E. coli BL21(DE3). Ekspresi protein diinduksi menggunakan IPTG dengan konsentrasi 0,5 dan 1,0 mM pada suhu 20°C dan 37°C untuk menentukan kondisi optimal yang dapat menghasilkan reteplase dalam bentuk terlarut. Aktivitas protein reteplase terlarut diuji menggunakan metode kaseinolisis radial dengan keberadaan plasma darah sebagai sumber plasminogen. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi optimal reteplase diperoleh pada suhu 37°C dengan konsentrasi IPTG 0,5 mM. Hasil uji aktivitas menunjukkan bahwa protein reteplase yang telah di fusi dengan sinyal peptida pelB dapat menghasilkan reteplase dalam bentuk terlarut dan memiliki aktivitas berdasarkan uji kaseinolisis radial. Sedangkan protein reteplase hasil fusi dengan sinyal peptida torA tidak memberikan aktivitas.