📚 Eksplorasi & Komparasi Topik Dokumen
Pencarian topik
Hasil Dokumen
Ditemukan: 3 dokumenDAMPAK SUPLEMENTASI GLUKOSA DALAM MEDIUM TERRIFIC BROTH (TB) TERHADAP PERTUMBUHAN DAN PRODUKTIVITAS E. COLI TOP10/ PCDNA3.1(+)_UTR_SPIKE
Plasmid merupakan molekul DNA sirkuler yang secara luas digunakan sebagai vektor dalam rekayasa genetika. Seiring meningkatnya kebutuhan global akan terapi berbasis genetik, maka permintaan terhadap plasmid semakin meningkat. Salah satu faktor yang mempengaruhi produktivitas plasmid adalah sumber dan metode pemberian nutrien, seperti karbon. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh suplementasi glukosa pada medium terrific broth (TB) terhadap pertumbuhan biomassa E. coli TOP10/pcDNA3.1(+)_UTR_spike dan produksi plasmid pcDNA3.1(+)_UTR_spike. Escherichia coli TOP10 rekombinan ini ditumbuhkan dalam medium TB yang mengandung ampisilin dan disuplementasi glukosa dengan konsentrasi 0, 2, 4, dan 8 g/L. Kultivasi dilakukan dengan agitasi 200 rpm selama 18 jam pada suhu 37°C. Hasil penelitian menunjukkan bahwa suplementasi glukosa pada medium TB dapat meningkatkan biomassa E. coli TOP10 (p?0.05) secara nyata. Suplementasi medium TB dengan glukosa 0, 2, 4, dan 8 g/L masingmasing menghasilkan biomassa sebesar 0.18, 0.21, 0.25, dan 0.27 mg DCW/mL. Namun demikian, kultur E. coli TOP10 rekombinan yang disuplementasi glukosa menunjukkan produksi plasmid yang lebih rendah (p?0.05) dibandingkan dengan kultur yang tidak disuplementasi glukosa. Konsentrasi plasmid di dalam sel E. coli TOP10 rekombinan yang ditumbuhkan pada medium TB yang disuplementasi dengan glukosa 0, 2, 4, dan 8 g/L berturut-turut menghasilkan plasmid sebesar 51.53, 42.51, 23.95, dan 10.55 ?g DNA pcDNA3.1(+)_UTR_spike/mg DCW.
REKAYASA KITOSANASE REKOMBINAN DARI BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS ABBD SEBAGAI SUBSTRAT SORTASE D
Sortase D merupakan enzim yang dapat menghidrolisis ikatan peptida pada protein yang memiliki sinyal penyortiran yang spesifik yaitu LPXTA. Reaksi hidrolisis protein oleh sortase D terjadi di antara dua residu threonin dan alanin pada motif LPXTA menggunakan residu katalitik sistein. Gen pengode kitosanase yang kami miliki mengandung motif yang mirip dengan sinyal penyortiran sortase D, yaitu GLXTA. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini adalah untuk merekayasa urutan asam amino penyusun kitosanase sehingga memiliki sinyal sortir yang dapat dikenali oleh Sortase D Rossellomorea aquimaris MKSC 6.2. (RaqSrtD). Penelitian ini diawali dengan merubah urutan gen pengode kitosanase sehingga memiliki kode untuk sinyal penyortiran LPXTA menggunakan site-directed mutagenesis (SDM). Perubahan kodon dilakukan pada G166L dan L167P menghasilkan csn1LP. Plasmid rekombinan pET-30a-csn1LP kemudian digunakan untuk mentransformasi E. coli TOP10F'. Verifikasi keberhasilan terbentuknya pET-30a-csn1LP dilakukan dengan analisis restriksi dan sekuensing. Klon rekombinan yang mengandung gen pengode Csn1LP dan RaqSrtD selanjutnya masing-masing diekspresikan pada E. coli BL21(DE3). Protein Csn1LP dihasilkan sebagai badan inklusi berukuran ~31 kDa. Sementara, RaqSrtD terbentuk sebagai protein larut yang berukuran ~28,3 kDa. Hasil reaksi antara protein badan inklusi Csn1LP dengan protein larut RaqSrtD yang diamati menggunakan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) belum menunjukkan pita produk hidrolisis (berukuran ~18,9 kDa dan ~12,5 kDa) yang meyakinkan. Namun, rekayasa kitosanase sehingga memiliki motif LPXTA telah berhasil dilakukan dan diverifikasi dengan sekuensing.
KONSTRUKSI PLASMID REKOMBINAN PBS0E-MISTIC-CYP71AV1-CPR
Artemisia annua, tanaman yang digunakan sebagai sumber komersial dan ekonomis dari artemisinin, memiliki kandungan artemisinin yang rendah sehingga membatasi komersialisasi produk ini. Salah satu upaya untuk mengatasi hal ini melalui pengembangan rekayasa jalur biosintesis melalui rekayasa genetika terhadap enzim-enzim yang berperan dalam produksi artemisinin menggunakan mikroba. CYP71AV1 serta CPR merupakan dua enzim yang terlibat dalam biosintesis asam artemisinat dan pBS0E merupakan shuttle vector dari Escherichia coli dan Bacillus subtilis. Dengan mengkonstruksi plasmid rekombinan pBS0E-Mistic-cyp71av1-CPR, diharapkan plasmid rekombinan tersebut dapat dihasilkan dengan mudah dan cepat di E. coli, serta dapat digunakan untuk ekspresi cyp71av1 dan CPR di B. subtilis. Saat ini, B. subtilis lebih menarik banyak perhatian untuk dikembangkan menjadi pabrik sel terpenoid karena statusnya yang aman (generally regarded as safe (GRAS)) dan kapasitas biosintesis prekursor isoprena yang tinggi. Pada percobaan ini, dilakukan konstruksi plasmid rekombinan pBS0E-Mistic-cyp71av1-CPR. Gen cyp71av1 dan CPR berasal dari vektor kloning pUC57. Upaya untuk memindahkan gen tersebut ke vektor ekspresi pBS0E memerlukan proses subkloning. Plasmid rekombinan tersebut ditransformasikan ke dalam E. coli. Konstruksi dan transformasi plasmid rekombinan pBS0E-Misticcyp71av1-CPR ke dalam E. coli telah dilakukan, namun koloni yang tumbuh tidak terkonfirmasi membawa plasmid rekombinan yang ditransformasikan. Meskipun diduga hasil ligasi telah berhasil menunjukkan integrasi fragmen DNA yang membawa gen cyp71av1 dan CPR ke dalam pBS0E, belum didapatkan transforman yang membawa plasmid rekombinan.